الف) مقدمه

سیستم‌ احیایی موجود درسیستم­های زنده در پیام‌رسانی سلولی، جابجایی ماکرومولکولی و تنظیم فیزیولوژیک نقش مهمی دارد. هر گونه اختلال در این سیستم باعث بروز انواع آسیب­های اکسیداتیو به سلول می­شود. گلوتاتیون یک مولکول تری پپتید است که از سه اسیدآمینه گلوتامات، سیستئین و گلایسین ساخته شده است. شکل احیا (GSH) آن در سیتوزول سلول­ها به ویژه سلول­های قرمز خون برای حفظ هموگلوبین در وضعیت احیا و جلوگیری از اکسیداسیون آن و همچنین سایر مولکول­های سلول حیاتی می­باشد. این مولکول در کنار مولکول­های دیگر سیستم آنتی ­اکسیدانتی سلول­ها یک مولکول حذف کننده پراکسید هیدروژن (توسط آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز GPX) و رادیکا­ل­های اکسیژن در نظر گرفته می ­شود. در سلول­ها GSH توسط آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز (GR) و به کمک NADPH2 تولیدی در مسیر پنتوز فسفات از گلوتاتیون اکسید (GSSG) ساخته می­ شود (شکل زیر). از آنجایی که کاهش و یا تخلیه GSH باعث بروز انواع اثرات سمی فاکتور­های محیطی و شیمیایی و در نتیجه انواع بیماری­ها می­ شود سنجش و برآورد سطح آن در سیستم­های زیستی در حوزه­های مختلف تحقیقاتی، دارویی و درمانی حائز اهمیت می­باشد.

ب) اساس سنجش

تیول‌ موجود در گلوتاتیون با معرف اِلمان یعنی دی‌تیو بیس ­نیتروبنزوئیک اسید (DNTB) واکنش می‌دهد و تولید نیتروتیوبنزوات (TNB) می‌کند که رنگ آن زرد می‌باشد و در طول موج nm412 قابل کمّی­ سازی است. شدت رنگ نسبت مستقیم با تیول‌های احیایی در نمونه دارد.کیت حاضر بر اساس معرف اِلمان(Ellman reagent) برای کمّی­ سازی گلوتاتیون احیا در نمونه‌هایی مثل پلاسما، سرم و بافت‌ها و ... طراحی شده است و حداقل تشخیص آن Mµ3/0 یا nmol/ml 3/0مولکول GSH می‌باشد.

ج) محتویات کیت

نگهداری کیت: تمامی اجزا سازنده کیت بجز استاندارد گلوتاتیون احیا (°C20-) را می­توان برای 6 ماه در یخچال نگهداری کرد.

د) روش کار

1- آماده­ سازی استاندارد

به طور کلی می­توان مقدار گلوتاتیون را هم توسط اسپکتروفتومتر و هم توسط میکروپلیت ریدر سنجید. بر اساس انتخاب محقق روش آماده­ سازی استاندارد و نمونه متغیر است.

الف) آماده سازی استاندارد به روش لوله آزمایش

در لوله آزمایش مطابق جدول زیر رقت­های سریالی از محلول گلوتاتیون احیا استاندارد mM 1، غلظت­های µM50- 0را برای حجم نهایی µl1000 تهیه کنید. برای تهیه محلول استاندارد گلوتاتیون از بافر رقیق ­کننده استفاده شود.

‌نکته: غلظت صفر در ستون آخر جدول فوق به عنوان بلانک در نظر گرفته شود.

ب) آماده­ سازی استاندارد به روش میکروپلیت

در این روش برای تهیه غلظت­های استانداردکافی است حجم­ های فوق همانند جدول زیر به یک پنجم تقلیل پیدا کند. آماده سازی استاندارد حداقل در تکرار­های دوتایی انجام شود.

 2- سنجش نمونه

الف) آماده سازی نمونه

برای سنجش گلوتاتیون نمونه ­های سلولی و بافتی باید قبل از سنجش هموژنیزاسیون انجام شود. اما نمونه­ های سرمی، پلاسمایی و یا مایعات بدن را می­توان بعد از تعیین غلظت پروتئین مستقیماً برای سنجش به کار برد.

• تهیه لیزات سلولی

تعداد 10⁶ سلول را جمع آوری کرده و با PBS شسته و بعد از حذف آن، رسوب سلولی را در^°C 80- تا زمان استفاده نگهداری کنید. برای تهیه لیزات سلولیµl100-50  از بافر لیز را به رسوب سلولی اضافه نمائید و سلول‌ها را با پیپت کردن کاملا حل کرده و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید اگر لیزات سلول ویسکوز یا چسبنده است مقدار بیشتری بافر لیز به آن اضافه نمایید و پیپت کردن را تکرار کنید.  سرانجام به مدت 5 دقیقه با حداکثر دور rpm )13000( آن را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را برای سنجش گلوتاتیون جمع آوری کنید. مقداری از مایع رویی را برای تعیین غلظت پروتئینی آن توسط روش برادفورد یا لوری اختصاص دهید.

• تهیه هموژنات بافتی

بافت باید کاملا با PBS شسته شود تا سلولهای خونی حذف شوند. mg200 از بافت را در یک میلی ­لیتر بافر لیز هموژن کرده و به مدت 5 دقیقه در میکروسانتریفیوژ یخچال دار با سرعت حداکثر سانتریفیوژ کنید و مایع رویی را برای سنجش تیول جمع آوری کنید. مقداری از مایع رویی را برای تعیین غلظت پروتئینی آن توسط روش برادفورد یا لوری اختصاص دهید.

نکته: برای بیان مقدار تیول بر حسب pr  nmol/mgباید غلظت پروتئین مایع رویی با یکی از روش‌های سنجش پروتئین مثل برادفورد یا لوری سنجیده شود.

ب) سنجش نمونه

• مقدار 20 الی µl100 از مایع رویی را در یک لوله آزمایش ریخته و با بافر رقیق ­کننده به حجم  µl400 رسانده شود.
• سپس µl 100 سولفوسالیسیلیک اسید به آن اضافه کرده و به مدت 10 دقیقه در روی یخ انکوبه کنید.
• پس از 5 دقیقه سانتریفیوژ با دور g 12000، کل محلول رویی را به میکروتیوب جدید منتقل و مقدار µl 400 بافر واکنش به هر یک بیفزایید.
• مقدار µl 100DTNB را به آن اضافه کنید.
• در نهایت جذب نمونه ­ها را در طول موج nm 412 قرائت کنید.

ه) آنالیز داده ­ها

نمودار زیر مربوط به استاندارد گلوتاتیون می­باشد. به کمک معادله خط برازش (Trendline)، کافی است مقدار x را پیدا کرده و آن را به غلظت پروتئینی نمونه که با برادفورد یا لوری سنجیده شده است تقسیم نمایید تا مقدار گلوتاتیون بر حسب pr nmol/mg یا µM به دست آید.

و) منابع

   Gaucher C, Boudier A, Bonetti J, Clarot I, Leroy P, Parent M. Glutathione: Antioxidant Properties Dedicated to Nanotechnologies. Antioxidants. 2018;7(5):62.

  Pakfetrat A, Dalirsani Z, Hashemy S, Ghazi A, Mostaan L, Anvari K, et al. Evaluation of serum levels of oxidized and reduced glutathione and total antioxidant capacity in patients with head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Therapeutics.[Original Article]. 2018 January 1, 2018;14(2):428-31.

پیوست‌ها

دریافت

[کیت سنجش گلوتاتیون احیا]

591 kB