کیت دقیق سنجش تیول تام

: آرسام فرا زیست

الف) مقدمه

سیستم‌های زیستی دارای اجزای احیایی هستندکه در پیام‌رسانی سلولی، جابجایی ماکرومولکولی و تنظیم فیزیولوژیک نقش مهمی دارد. استرس اکسیداتیو به واسطه تغییر در فعالیت آنزیم‌ها، گیرنده‌ها، انتقال دهنده‌ها، فاکتورهای رونویسی و ماکرومولکول‌ها باعث از بین رفتن چرخه احیایی شده که پیامد آن عدم تعادل بین سیستم آنتی اکسیدانتی و پرواکسیدانتی می‌باشد. از آنجایی که بسیاری از پروتئین‌ها دارای تیول آزاد حساس به سیستم احیایی هستند، تعیین و کمّی سازی حالت احیایی آنها سطح استرس اکسیداتیو نمونه را نشان می‌دهد.

کیت حاضر بر اساس معرف اِلمان (Ellman reagent) برای کمّی سازی تیول‌های احیا کل در نمونه‌هایی مثل پلاسما، سرم و بافت‌ها و ... طراحی شده است. تیول کل شامل تیول مولکولهای کوچک مثل گلوتاتیون، سیستئین، هوموسیستئین و همچنین تیول موجود در سطح پروتئین های محلول میباشد.

ب) اساس سنجش

مطابق با شکل زیر تیول‌های آزاد موجود در محیط یا در سطح پروتئین با معرف اِلمان یعنی دی‌ تیو بیس نیترو بنزوئیک اسید (DNTB) واکنش می‌دهد و تولید نیتروتیوبنزوات (TNB) می‌کند که رنگ آن زرد می‌باشد و در طول موج nm412 قابل کمّیسازی است. شدت رنگ نسبت مستقیم با تیول‌های احیایی در نمونه دارد. حداقل تشخیص کیت حاضرMµ5/2 یا nmol/mg pr 5/2 تیول می‌باشد.

ج) محتویات کیت

نگهداری کیت: تمامی اجزا سازنده کیت را بجز استاندارد تیول (°C 20-) میتوان برای 6 ماه در یخچال نگهداری کرد.

د) روش کار

1- آماده سازی استاندارد

به طور کلی میتوان مقدار تیول را هم توسط اسپکتروفتومتر و هم توسط میکروپلیت ریدر سنجید. بر اساس انتخاب محقق روش آماده سازی استاندارد و نمونه متغیر است.

آماده سازی استاندارد به روش لوله آزمایش

در لوله آزمایش مطابق جدول زیر رقتهای سریالی از محلول سیستئین استاندارد mM 10، غلظتهای µM400- 0را برای حجم نهایی µl1000 تهیه کنید. برای تهیه محلول استاندارد سیستئین از بافر رقیق کننده استفاده شود.

‌نکته: غلظت صفر در ستون آخر جدول فوق به عنوان بلانک در نظر گرفته شود.

آماده سازی استاندارد به روش میکروپلیت

در این روش برای تهیه غلظتهای استانداردکافی است حجمهای فوق همانند جدول زیر به یک پنجم تقلیل پیدا کند. آماده سازی استاندارد حداقل در تکرارهای دوتایی انجام شود.

2- آماده‌سازی نمونه

برای سنجش تیول تام نمونههای سلولی و بافتی باید قبل از سنجش هموژنیزاسیون انجام شود. اما نمونه های سرمی، پلاسمایی و یا مایعات بدن را می توان بعد از تعیین غلظت پروتئین مستقیماً برای سنجش به کار برد.

تهیه لیزات سلولی

10⁶ سلول را جمع آوری کرده و با PBS شسته و بعد از حذف آن، پِلِت سلولی را در^°C 80- تا زمان استفاده نگهداری کنید. برای تهیه لیزات سلولیµl100-50 از بافر لیز را به پلت سلولی اضافه نمائید و سلول‌ها را با پیپت کردن کاملا حل کرده و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید اگر لیزات سلول ویسکوز یا چسبنده است مقدار بیشتری بافر لیز به آن اضافه نمایید و پیپت کردن را تکرار کنید. سرانجام به مدت 5 دقیقه با حداکثر دور rpm )13000( آن را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را برای سنجش تیول جمع آوری کنید. مقداری از مایع رویی را برای تعیین غلظت پروتئینی آن توسط روش برادفورد یا لوری اختصاص دهید.

تهیه هموژنات بافتی

بافت باید کاملا با PBS شسته شود تا سلولهای خونی حذف شوند. mg200 از بافت را در یک میلیلیتر بافر لیز هموژن کرده و به مدت 5 دقیقه در میکروسانتریفیوژ یخچال دار با سرعت حداکثر سانتریفیوژ کنید و مایع رویی را برای سنجش تیول جمع آوری کنید. مقداری از مایع رویی را برای تعیین غلظت پروتئینی آن توسط روش برادفورد یا لوری اختصاص دهید.

نکته: برای بیان مقدار تیول بر حسب prnmol/mgباید غلظت پروتئین مایع رویی با یکی از روش‌های سنجش پروتئین مثل برادفورد یا لوری سنجیده شود.

3- سنجش نمونه مجهول

مقدار 10 الی µl100 از مایع رویی را در یک لوله آزمایش ریخته و با بافر رقیقکننده به حجم µl400 رسانده شود.
مقدار µl 100DTNB به آن اضافه کنید.
پس از گذشت 5 دقیقه، µl 100 سولفوسالیسیلیک اسید به آن افزوده و به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه کنید.
پس از 5 دقیقه سانتریفیوژ با دور g 12000، کل محلول رویی را به میکروتیوب جدید منتقل و مقدار µl 400 بافر واکنش به هر یک بیفزایید و دوباره بادور g 12000 سانتریفیوژ نمایید.
در نهایت جذب نمونهها را در طول موج nm 412 قرائت کنید.

ه) آنالیز داده ها

نمودار زیر مربوط به استاندارد تیول می باشد. به کمک معادله خط برازش (Trendline) آن کافی است مقدار x را پیدا کرده و آن را به غلظت پروتئینی نمونه که با برادفورد یا لوری سنجیده شده است تقسیم نمایید تا مقدار تیول بر حسب prnmol/mg یا prµM/mg به دست آید.